Principe du retardement sur gel

[Son-Goku]

Bonjour !

J’ai du mal a saisir a quoi sert et comment fonctionne la technique de retardement qu’en sur Gel. Surtout à partir du moment où on rajoute les compétiteurs. (Je comprend que s’il la protéine se fixe la bande est plus lourde donc il y’a un retard)

Quelqu’un peut il m’expliquer ? J’avoue que le cours du tat m’a plus embrouillé a qu’autre chose ...

[SandieP]

Coucouuuu ! alors je vais te réécrire ce que j'avais noté en cours, et tu me dis si il y a un truc que tu ne comprends pas, j'essaierai de mieux détailler 

 

                                                                

 

On imagine que l’on cherche à montrer qu’une protéine particulière peut interagir avec une séquence donnée. On utilise la technique de retardement sur gel/EMSA. 

(suis les numéros avec les bandes du schéma)

 

(1) On prend un oligonucléotide de séquence bien définie. On le fait migrer à l’électrophorèse; on a un nucléotide fluorescent bi caténaire marqué. 

 

(2) On y fait réagir la protéine (dont on pense que c’est un facteur de transcription) et on fait l’électrophorèse. On voit apparaître une seconde bande retardée par rapport à la 1ère. Il y a eu une interaction entre la protéine et l’oligonucléotide, et donc la formation d’un complexe, qui est donc retardé.

 

(3) On rajoute des oligonucléotides spécifiques non marqués, qui sont des compétiteurs spécifiques du nucléotide de départ (c’est-à-dire qu’ils ont la même séquence). Mais on en met 10 fois plus. On ajoute aussi la protéine. 
On remarque que la bande retardée est atténuée. Le complexe formé précédemment est atténué à cause des oligonucléotides non marqués spécifiques qui rentrent en compétition car ils ont été mis en excès.

 

(4) On refait la même chose mais avec des oligonucléotides non spécifiques non marqués. On en met toujours en excès. Cette fois ci il n’y a pas d’interaction entre cet oligonucléotide non spécifique et la protéine. C’est pourquoi la bande retardée n’est plus atténuée.

/!\ Si il y avait une diminution de la bande retardée, cela voudrait dire que l’interaction nucléotide marqué/protéine est non spécifique, car même un oligonucléotide non spécifique aurait rompu cet interaction. On voit donc ici une spécificité entre notre nucléotide marqué et la protéine.

 

(5) On peut aussi utiliser un anticorps spécifique à la protéine. On vérifie si cet anticorps s’y accroche bien, et ne s’accroche pas à un isofacteur (protéines différentes qui reconnaîtraient la même séquence de l’oligonucléotide marqué). Le complexe formé permet l’identification du facteur spécifique.
La bande est encore plus retardée à cause de l’anticorps. 

 

Voilà ! Normalement c'est bon et si quelqu'un a quelque chose à rajouter/compléter j'attends ça 

[Son-Goku]

Merci beaucoup ! Je croyais que les compétiteurs spécifiques n’avaient pas la même séquence..

[Son-Goku]

Je fais remonter le sujet, mais je me demande, à quoi correspondent les + et les -?

Et si quelqu’un peut détailler un peu plus la partie avec l’anticorps merci !

[SandieP]

A la présence de l'agent ou pas selon la bande/étape,

 

+ = présence

- = absence

 

tu as des + partout pour l'oligo DNA marqué car on le met tout le temps

tu as un seul + à la toute fin pour l'anticorps car on l'a utilisé qu'à la fin