western blot

[lemi31]

Salut  

 

J'aimerais savoir, lorsqu'on fait une detection d'un anti-c en condition denaturante, vous me confirmez que ça veut pas forcemment dire que l'epitope reconnu est sequentiel dans la mesure où la condition denaturante n'abime pas TOUS les epitopes conformationnels? 

parce que selon les années, il y a des contradictions 

 

merci d'avance ! 

[Fugu]

La plupart du temps on considère que les conditions dénaturantes enlèvent tout épitoges conformationnels sinon cela complique les conclusions, en tout cas cette année elle l'a dit en cours.

Peut-être que dans des années antérieurs ils ne faisaient pas exactement les mêmes exercices d'où l'incohérence   

 

 

Donc au final si l'épitoge reconnu est séquentiel 

[lemi31]

daccord je vois merci  

 

est-ce que tu te souviens si lors du TD elle a pas dit qu'il fallait avoir deux sites au niveau de plasmide pour l'insertion (ça peut être les memes mais il en faut 2) 

Moi c'est ce qui me semblait avoir entendu mais en fesant le poly de paques je me rends compte que ça peut être faux 

[Fugu]

Oui il en faut toujours deux, je me souviens qu'elle avait beaucoup insisté là-desuss, qu'il y avait des items faux à cause de ça en plus je crois. 
 

Mais après sur les plasmides quelqu'un d'autres t'aiderait mieux que moi, je vais demander du renfort  

[lemi31]

oui voilà c'est ce qui me semblait, petit pb selon les années aussi  

 

merci en tout cas  

[MrPouple]

Le renfort a été appelé (fin on fait avec ce qu'il y a)  

 

Pour insérer un DNAc, tu dois d'abord l'isoler de sa séquence. Et pour ça, tu es obligé d'utiliser de couper eu aval et en amont => tu dois avoir obligatoirement deux sites de restrictions. (il peuvent être identiques).

 

Pour le plasmide, c'est comme ouvrir un corde. Tu as alors deux possibilités => soit tu utilises deux enzymes différentes, ce qui s'apparente à exciser une partie de la corde pour ensuite la remplacer par du cDNA. Soit tu coupe la corde en un seul point (et tu te retrouves avec deux sites de restrictions identiques).

 

Il est nécessaire que le site en aval du cDNA et celui en aval de la coupure correspondent, de même pour les sites en amont (tu ne peux pas insérer ton cDNA si un seul coté s'attache tu vois ce que je veux dire ?. Si tu trouves un QCM ou cela est vrai je t'invite à le partager

 

Tu dois faire aussi attention à un piège : le cDNA peut s'insérer dans les deux sens, donc si l'item stipule insertion fonctionnelle => faire attention au sens

 

Voilà n'hésite pas si tu as d'autres questions ! 

[lemi31]

bah le renfort m'a vachement aidé parce que j'avais pas compris ça  

non du coup c'est mon erreur à moi j'ai cru que le plasmide devait etre également coupé à deux endroits, merci de ton aide  

 

que veux-tu dire par insertion fonctionnelle?

[MrPouple]

Il peut être coupé à deux endroits mais tu peux aussi utiliser une seule enzyme, BamH1 par exemple, qui va couper le plasmide au niveau du site de restriction et créer deux bouts en baïonnette utilisables Par contre l'utilisation de la phosphatase alcaline devient obligatoire pour éviter que le plasmide ne se referme. Après cela te créer deux sites identiques donc tu auras forcément une insertion possible dans les deux sens, ce qui me mène à te deuxième question : 

 

Une insertion qui est fonctionnelle (c'est pas un terme scientifique, du cours, juste un que j'ai choisi ) , donc ce que j'entends par fonctionnelle, c'est que l'ADNc va s'insérer dans le bon sens. En effet, tu n'es pas sans savoir qu'il existe un sens de transcription? Donc en gros si tu insères ton codon STOP a début et que tu as l'ATG à la fin, tu fais un facepalm avant de t'y remettre C'est donc de pouvoir transcrire l'ARNm correctement pour que celui mène à une protéine par la suite !

[lemi31]

daccord merci beaucoup pour tout! passe une bonne journée!  

[MrPouple]

Avec plaisir, merci toi aussi !