Cours techniques d’études de l’ADN

[amelie.chm]

Bonjour j’ai deux questions concernant le QCM 5 du poly sur les techniques d’études de l’ADN. 
Lorsqu’on coupe le plasmide avec deux enzymes de restriction, est ce qu’il faut toujours garder le fragment avec l’origine de réplication ou est ce qu’il y a des exceptions ? 

Dans l’item D du QCM 5 de ce cours la correction nous dit que puisque le plasmide recombiné de 1730b ne possède qu’un seul site de restriction sensible à Ddd, son action générera donc un fragment de 1730b. Je pensais plutôt que si on coupe à Ddd, on obtient deux fragments plus petits. 
Merci d’avance 

[POMME]

Salut, je ne pense pas qu’il y est d’exception pour l’origine de réplication car pour le coup en a forcément besoin d’une mais je laisse une tuteur ou RM confirmer au cas où.

Pour la deuxième question, effectivement si tu a un seul site de restriction pour le Ddd tu n’obtiendra qu’un seul fragment de 1730b qui correspond a ton plasmide qui aura été simplement ouvert. C’est comme si tu coupe un élastique ou bracelet à un seul endroit, il fera toujours la même taille, il sera juste ouvert. 

[amelie.chm]

il y a 1 minute, POMME a dit :

Salut, je ne pense pas qu’il y est d’exception pour l’origine de réplication car pour le coup en a forcément besoin d’une mais je laisse une tuteur ou RM confirmer au cas où.

Pour la deuxième question, effectivement si tu a un seul site de restriction pour le Ddd tu n’obtiendra qu’un seul fragment de 1730b qui correspond a ton plasmide qui aura été simplement ouvert. C’est comme si tu coupe un élastique ou bracelet à un seul endroit, il fera toujours la même taille, il sera juste ouvert. 

Parfait merci beaucoup j’ai une autre question dans l’item E du QCM 7 on nous dit qu’après coupure par deux enzymes différentes, l’insert ne peut se mettre que dans un seul sens puisqu’il s’agit d’un clonage orienté. Je pensais que l’insert pouvait se mettre dans les deux sens mais qu’un seul des deux pouvait fonctionner. Ducoup à l’exam il aurait fallu mettre vrai ou faux ? 

[POMME]

il y a 1 minute, amelie.chm a dit :

Parfait merci beaucoup j’ai une autre question dans l’item E du QCM 7 on nous dit qu’après coupure par deux enzymes différentes, l’insert ne peut se mettre que dans un seul sens puisqu’il s’agit d’un clonage orienté. Je pensais que l’insert pouvait se mettre dans les deux sens mais qu’un seul des deux pouvait fonctionner. Ducoup à l’exam il aurait fallu mettre vrai ou faux ? 

Enfaite c’est vrai car tu utilise deux enzymes différentes par exemple dans le QCM BamH1 et Xho1, dans ce cas tu vas couper ton plasmide et ton insert avec ces deux mêmes enzymes, le site BamH1 de l’insert se fixera au niveau du site BamH1 du vecteur et le site Xho1 de l’insert se fixera au niveau du site Xho1 du vecteur. C’est pour cela qu’il faut bien faire attention aux enzymes utilisées pour ne pas insérer ton insert dans le mauvais sens. C’est ce qu’on appel un clonage orienté

Si on utilise une seule enzyme, dans ce cas l’insert pourra se mettre dans les deux sens puisque les sites de liaison sont identique (je sais pas si c’est clair dit comme ça). On aura alors certain plasmide ou l’insert sera dans le bon sens et d’autres ou il sera dans le mauvais sens. Ainsi il faudra ajouter une étape supplémentaire de sélection pour ne garder que les plasmides fonctionnels.

Est-ce que c’est plus clair pour toi maintenant ?

[matthieucaryote]

Salut @amelie.chm!

 

Désolé de la réponse tardive mais du coup je suis d'accord avec @POMME sur ce qu'elle t'a dit !

 

 

[amelie.chm]

il y a 38 minutes, POMME a dit :

Enfaite c’est vrai car tu utilise deux enzymes différentes par exemple dans le QCM BamH1 et Xho1, dans ce cas tu vas couper ton plasmide et ton insert avec ces deux mêmes enzymes, le site BamH1 de l’insert se fixera au niveau du site BamH1 du vecteur et le site Xho1 de l’insert se fixera au niveau du site Xho1 du vecteur. C’est pour cela qu’il faut bien faire attention aux enzymes utilisées pour ne pas insérer ton insert dans le mauvais sens. C’est ce qu’on appel un clonage orienté

Si on utilise une seule enzyme, dans ce cas l’insert pourra se mettre dans les deux sens puisque les sites de liaison sont identique (je sais pas si c’est clair dit comme ça). On aura alors certain plasmide ou l’insert sera dans le bon sens et d’autres ou il sera dans le mauvais sens. Ainsi il faudra ajouter une étape supplémentaire de sélection pour ne garder que les plasmides fonctionnels.

Est-ce que c’est plus clair pour toi maintenant ?

J’ai bien compris mais dans ce cas je pense qu’il y a une erreur de formulation dans le cours du poly page 47 en bas de la page : « si le clonage est orienté, l’insert ne peut être que dans un seul sens, pour le déterminer, il suffit de repérer les sites de restrictions qui sont identiques sur le vecteur et sur l’insert, le plus souvent c’est dans le bon sens »;  « le plus souvent » ça insinue que des fois c’est dans le mauvais sens même sur du clonage orienté.

[matthieucaryote]

Je pense que ce "le plus souvent" est un abus de langage. En gros selon les enzymes de restriction que tu vas utiliser ça va forcément orienter ton insert. Mais si tu as une seule enzyme de restriction, là ça peut se mettre dans le mauvais sens puisque ça marche des deux côtés!

 

[An-Schwann]

10 minutes ago, amelie.chm said:

J’ai bien compris mais dans ce cas je pense qu’il y a une erreur de formulation dans le cours du poly page 47 en bas de la page : « si le clonage est orienté, l’insert ne peut être que dans un seul sens, pour le déterminer, il suffit de repérer les sites de restrictions qui sont identiques sur le vecteur et sur l’insert, le plus souvent c’est dans le bon sens »;  « le plus souvent » ça insinue que des fois c’est dans le mauvais sens même sur du clonage orienté.

Salut!

En effet on le changera pour éviter future confusion. C'est écrit ça car il peut toujours avoir des exceptions, mais au concours il faut penser, clonage orienté= un sens 

[amelie.chm]

Ok mercii beaucoup