4 types de plasmides

[Skalbain]

QCM 6 La construction plasmidique pour exprimer MART a été réalisée de la façon suivante : les plasmides A et B (représentés ci-dessous) ont été digérés par BamH1, puis le plasmide A digéré a été traité par la phosphatase alcaline. Le fragment de 600 pb (fragment C) correspondant au promoteur tissu spécifique a été purifié. Une ligation du plasmide A digéré et traité par la phosphatase avec le fragment C a été ensuite réalisée. Pour finir, des bactéries compétentes ont été transformées par le produit de ligation.

https://ibb.co/GKRWd2W

Après ligation et compte tenu que la phosphatase alcaline n'est pas très performante nous obtenons 4 types de plasmides différents, c'est dit faux et dit 3. Dans tous les cas l'adn correspondant au promoteur ne pourra pas se lier, ils devraient etre tous vide.

Comment le clonage peut etre non orienté mis directionnel ? Merci infiniment

[An-Schwann]

5 minutes ago, Skalbain said:

Comment le clonage peut etre non orienté mis directionnel ?

Coucou!

Qu'est ce que tu veux dire par ça? 

[mate_ces_teh]

Je suis pas sûr de comprendre la question non plus, mais pour moi on devrait avoir 3 types de plasmides (on est sur un clonage non orienté) :

Un plasmide qui n'a pas intégré le fragment

Un qui l'a intégré dans le bon sens

Un qui l'a intégré dans le sens inverse

[Saracémique]

En fait la phosphatase alcaline empêche la religation du plasmide sur lui-même, pas l’insertion d’un fragment phosphorylé.

Ici le plasmide est digéré par BamHI et déphosphorylé (ça retire les 5’P).

Le fragment C (600 pb) est digéré par BamHI et il reste phosphorylé sur ses deux extrémités

Lors de la ligation :

le fragment C apporte les 5’ phosphates nécessaires.

La ligase peut donc lier  le 5’P (insert) et 3’OH (plasmide)

donc le fragment peut s’insérer dans le plasmide.
Donc au final on obtient 3 types de plasmides : 1 vide, 1 avec le fragment dans le bon sens et un autre avec le fragment dans le mauvais sens. 

 

[Skalbain]

Merci, je reformule comment le clonage peut etre non orienté mais avec bon et mauvais sens

[Saracémique]

Justement, s’il est non orienté ça veut dire que l’insert peut s’insérer dans un sens ou dans l’autre (il fait « comme il veut »). On choisira à la fin le sens qui correspond bien à la séquence d’intérêt c’est à dire avec le codon d’initiation du bon côté. 
Par contre si le clonage est orienté, on « oblige » l’insert à s’intégrer que dans un seul et unique sens. on aura donc un seul type de plasmide recombinant contenant la séquence intégrée comme on le souhaitait (en fonction des enzymes de restriction qu’on a choisies). 
 

J’espère que j’ai pu mieux répondre à ta question, n’hésite pas si c’est pas clair :)