Techniques d’étude de l’ADN.

[Lilactate]

Bonjour, je ne comprends trop ces items : 

B. Pour obtenir un plasmide recombinant exprimant le gène de la résistance à l’ampicilline chez les procaryotes, on peut digérer le plasmide pINSULINE avec la cassette d’expression linéarisée, BamH1 et Noct1. 

C. Pour obtenir un plasmide recombinant exprimant le gène de la résistance à l’ampicilline chez les proca - ryotes, on peut digérer le plasmide pINSULINE avec la cassette d’expression linéarisée, BamH1 et HindIII.

En fait, je ne sais pas vraiment comment les aborder et les traiter…

Est ce que quelqu’un pourrait m’expliquer svp ? 

Merci !

[Androma]

Salut ! 

 

Dans ce plasmide, à gauche, il y a le gène codant pour la résistance à l'ampicilline. Pour l'instant, il est sous le contrôle d'un promoteur eucaryote constitutif. Dans ces deux items, on cherche à mettre ce gène sous le contrôle d'un promoteur procaryote. On a un promoteur procaryote dans la séquence représentée en dessous du plasmide (ce qu'ils appellent la cassette d'expression linéarisée).

 

On va donc essayer de trouver les bons enzyme pour enlever le promoteur eucaryote et le remplacer par le promoteur procaryote.

Juste avant les 2 promoteurs il y a un site de reconnaissance de BamH1. C'est donc un bol enzyme pour l'opération voulue puisque elle coupe au même endroit pour les 2 promoteurs (par exemple si le site de BamH1 était après le promoteur dans le plasmide mais avant dans la cassette, le promoteur serait inséré à l'envers).

 

Pour l'item C, on regarde les sites de reconnaissance de HindIII. Il y a un site juste après le promoteur eucaryote dans le plasmide, et un site juste après le promoteur procaryote dans la cassette.

L'item C est donc vrai, on peut obtenir un plasmide recombinant exprimant le gène de la résistance à l'ampicilline chez les procaryotes en digérant avec BamH1 et HindIII.

 

Pour l'item B, il faut faire la même chose avec Noct1. Il y a bien un site de reconnaissance après les deux promoteurs. Cependant, dans la cassette, il y a un deuxième site BamH1 après le promoteur, avant le site Noct1. Les enzymes ne choisissent pas là où ils coupent : dès qu'il y a un site, ça coupe. Donc le promoteur procaryote sera entouré de 2 sites BamH1, et le site Noct1 sera à part. Il ne pourra pas s'insérer dans le plasmide avant le gène. 

L'item B est donc faux.

 

J'espère que c'est plus clair pour toi, sinon n'hésite pas à me le dire :)

[An-Schwann]

J'ai un petit doute sur l'item B, peut tu nous préciser la correction?

[Lilactate]

Super merci beaucoup, j’ai compris !! Et l’item B était bien faux de mémoire :) 

[An-Schwann]

1 hour ago, Lilactate said:

Super merci beaucoup, j’ai compris !! Et l’item B était bien faux de mémoire :) 

Génial alors tout ce que le tuteur a dis est bon!!