HELPPPP BMC (biomol) L2 BCP

[Passensible]

Bonjour, 

je voulais svp vous demander de l’aide car je suis TRÈS bloquée sur cet exercice de l’annale 2023: 

Je ne comprend pas pq la réponse C est la bonne, je vous avoue que l’histoire de décalage de phase (comme je vois ici ils ont rajoutés TT avant ATG), je l’avais compris que sur l’unique exemple en td mais je n’arrive pas à le refaire moi même sur d’autres exemples 

j’avais éliminé la B et la D parce qu’en dessinant les amorces à queues flottantes classiques à partir de la sequence de GH1, j’avais trouvé la 2e amorce (et encore jsp si c’est ca qu’il fallait faire), voici ce que j’avais fais: 

 

Si une âme charitable peut SVP m’expliquer le mécanisme avec le MCS,…. Et aussi comment trouver la taille de la prot de fusion 6Xhist FLAG GH1 sachant que la taille de GH1 est de 177AA svp? 

 

Merci BCP d’avance!

[Lénadénine]

Coucou ! Si ça peut te rassurer l’année dernière j’ai mis aussi beaucoup de temps à comprendre ce genre d’exercices mais à force de s’entraîner ça va tout seul donc je te conseille de refaire le TD et de faire les annales! 

 

Du coup je vais essayer de t’expliquer comme je peux mais j’avoue à l’écrit c’est pas facile aha donc hésites pas à me dire si t’as rien compris promis je me vexerai pas.

 

Ici ton objectif va être de créer une protéine recombinante avec 6xHis, FLAG et GH1. C’est à dire que tu vas avoir une séquence qui pourra coder pour ces trois protéines à la suite. Pour ça t’as un plasmide qui contint déjà 6xHis et FLAG donc il faut que tu rajoute GH1 à la suite de FLAG. Pour ça tu vas utiliser le MCS du vecteur et des amorces à queues flottantes car là tu veux faire un clonage orienté. Dans ton MCS tu trouves tes enzymes de restriction que tu vas utiliser qui sont BAMH1 et ECOR1. C’est donc avec ces deux séquences d’enzyme que tu vas pouvoir insérer ta séquence de GH1 dans le plasmide. 

Sauf que là arrive le problème de si tu insères ta séquence telle quelle avec tes deux sites de restriction eh ben au moment de la traduction ça ne va pas marcher tu ne te retrouveras pas avec ta protéine recombinante que tu souhaites mais avec un décalage de phase. 

Ce décalage de phase est du au fait que la traduction de la protéine va commencer à l’ATG de ton plasmide avant la séquence de 6xHis et ensuite arrivé à la séquence de GH1 il va manquer 2 nucléotides pour conserver la phase de la traduction complète de ta protéine GH1 qui commence par un ATG (méthionine). Si tu ne rajoutes pas ces deux nucléotides tu te retrouves avec un codon CAT qui code pour une histine puis un GGC qui code pour une glycine et pas un GCT (deuxième acide aminé de GH1) qui code pour une alanine. 

J’ai essayé de te faire un schéma (pas ouf mais tkt l’effort est là) pour t’expliquer ça: 

 

Ensuite pour trouver la taille de la protéine recombinante c’est simple, il suffit juste d’ajouter à la taille de GH1,les acide aminé codés en amont de cette protéines (les soulignés en rose sur mon schéma) soit 36 codons donc acide aminé supplémentaires. On a donc 177+36=213 acides aminés pour cette protéine recombinante. 

 

Voilà j’espère que c’es plus clair et surtout n’hésites vraiment pas si tu as encore des questions ! Bon courage!

[Passensible]

Merci bcp @Lénadénined'avoir pris le temps de me répondre. J'ai mieux compris en effet, mais y a juste qlq petits trucs où c'est encore un petit peu flou: 

ou est ce que j'insere ma sequence GH1, après le premier G de BamH1?

Aussi, ca veut dire que pr la premiere amorce je m'arrete directement apres le site de restriction BamH1? et donc pr la 2e je fais comment?

 

Merci bcp d'avance!! Je t'avoue c'est un peu (trop) dur étant donné que les annales ne sont pas corrigés en details et aucune IA n'est forte dans ce genre de qsts

[Lénadénine]

Ah oui j’ai oublié de préciser un truc. En gros vu que la séquence que tu veux insérer dans ton plasmide c’est la dernière de ta protéine recombinante, dans ton amorce à queue flottante le décalage de phase il sera à regarder que pour BAMH1 car en effet ton codon stop sera directement inclut dans ta séquence GH1 donc on rajoute pas de nucléotide avant ECOR1 dans ce cas. Là j’ai pas d’exemples mais il se peut que tu trouves des exercices ou il faut rajouter des nucléotides avant le deuxième site de restriction, si jamais tu en vois et que t’as pas très bien compris ce que je disais n’hésites pas à me dire ! 

 

Ici ta séquence GH1 elle va s’insérer grâce au site de restriction BamH1 et ECOR1 mais dans ton amorce tu dois avoir ces deux sites aussi présents, donc dans ton amorce ta séquence se met après BAMH1 après les 2 nucléotides ajoutées. Et dans ton plasmide on retrouvera ton insert qui aura été « coupé » avec l’enzyme de restriction directement après le premier G de BamH1 mais il y aura toujours la séquence de ton site de restriction après légation. Je te laisse te référer au cours sur le clonage pour comprendre ça avec les clonages directs et indirects… Je sais pas si c’est plus clair ?