Recombinaison

[Mj09r]

Bonjour j'ai du mal à comprendre le lien d'avoir des cellules ES recombinantes resistante au G418 et au ganciclovir et leur injection dans un blastocyste de souris à pelage noir? quelle est l'utilité d'avoir ce nouvel allèle recombinant ? Merci.

[Gwendoline_sabat]

Bonjour,

 

je ne suis pas sûre de parfaitement saisir la question, du coup je te donne ma réponse et tu me diras si ça te convient !

 

On veut voir les conséquences de l'invalidation de l'expression d'une protéine. On casse donc la séquence codante avec des enzymes de restriction et on insère à cet endroit le gène de résistance à la néomycine. Puis, on ajoute à la fin du fragment le gène de la thymidine kinase. Cette séquence est donc résistante à la néomycine (G418) et sensible au ganciclovir. Lors de la recombinaison homologue (événement rare que l'on veut voir se réaliser) on aura insertion de la néomycine sur l'ADN génomique de la cellule ES à partir du fragment linéaire qu'on aura construit et il y aura excision de TK sur le fragment linéaire. On a donc un allèle recombinant résistant à la néomycine et au ganciclovir. Maintenant, pour sélectionner les cellules qui auront bien réalisé la recombinaison homologue, il suffira de les traiter par néomycine et ganciclovir.

 

Néanmoins, il n'y a qu'un allèle recombinant. Pour observer les conséquences de l'invalidation de l'expression d'une protéine, il va nous falloir faire en sorte d'obtenir des individus homozygotes pour l'allèle recombinant. C'est là qu'interviennent les souris !

 

Les cellules ES recombinantes résistantes au G418 et au ganciclovir sont marrons. On les injecte dans le blastocèle de souris à pelage noir, elles viennent participer à la masse interne (qui jusqu'alors ne contenait que des cellules qui aboutissaient à un pelage noir).
A la naissance, si toutes les souris sont noires, c'est raté car tout leur pelage dérive de cellules qui viennent de la masse interne originelle.
Si elles ont les 2 couleurs, les cellules qui déterminent le pelage ont pour origine soit la cellule de la souris marron avec l'allèle recombinant soit la cellule de la souris noire.
On sélectionne les souris les plus marron possible car les cellules de son organisme dérivent majoritairement de cellules de souris au pelage marron (allèle recombinant).
On accouple cette souris la plus marron possible avec une souris noire et on regarde les souriceaux. Si on a des petits marrons alors les cellules germinales de la souris qu'on a sélectionnée tout à l'heure car elle était la plus marron de toutes portaient bien l'allèle muté.
Les souriceaux de notre souris la plus marron et de la souris noire (qui sont marrons) sont hétérozygotes. Si tu les accouples ensemble (les hétérozygotes), tu as 25% de chances d'obtenir une souris marron homozygote pour l'allèle muté, ce qui te permettra d'en observer les conséquences.

 

Bon courage pour les révisions

[Mj09r]

Merci et desolé de répondre aussi tard en fait je comprends pas comment le fait de créer des cellules ES resistante au ganciclovir et au G418 de cellules marrons va permettre ensuite de faire des souris mosaïque?, j'ai pas bien compris l'étape de recombinaison homologue :/