BMC L2 BCP qst inserts

[Passensible]

Bonjour, 

 

J’ai bcp de mal avec les notions de non orienté/orienté car je n’arrive à visualiser OU l’insert va se mettre? Je comprends les diff coupures et je comprend pq on passe de cette séquence à cette séquence après coupure, mais je ne vois vrm pas où l’insert va se poser pr qu’il y ait une ou 2 orientations possible?

Qlq peut m’expliquer avec les exemples des séquences du cours svp? 

 

Citation

@PetiteComète help plsss

 

+ le concept de pcr à queues flottantes, c’est vrm assez fou et je ne vois pas à quoi ça sert? 

 

Merci bcp d’avance!!!!

Edited September 10, 2025 by Passensible

[emma-tie]

Coucouuu !

 

Déjà pour commencer : 

 

Clonage non orienté = l'insert (séquences ADN qu'on rajoute dans le vecteur) peut s'orienter dans les 2 sens. C'est le cas des  :

• inserts à bords francs (coupés droits et donc pas de complémentarité nécessaires pour s'insérer)
• Inserts à bords cohésifs avec 1 enzyme => même bords "libres" => double sens d'insertion 
• et des inserts à bords cohésifs avec 2 enzymes COMPATIBLES (càd que les 2 sites de restrictions sont compatibles :
  • Exemple : ce qui est souligné est identique => complémentarité possible

5' NNNNNNNGGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGATCTNNNNNNNNNN 3'
3' NNNNNNNCCTAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAGANNNNNNNNNN 5'

 

5' GATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNA 3'
                  3'  GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAG 5'

 

Bords "libres" identiques (Attention sens 5'-3') = compatibles : 5' GATC 3' => pour s'insérer va devoir avoir complémentarité

MAIS comme c'est pareil des deux cotés = peut s'orienter dans les 2 sens (comme bords francs)

Rappel : le plasmide est coupé par les mêmes enzymes, donc ca va s'insérer par complémentarité avec cette séquence 5' GATC 3'

 

Clonage orienté = l'insert (séquences ADN qu'on rajoute dans le vecteur) peut s'orienter dans un SEUL sens. C'est le cas des inserts à bords cohésifs avec 2 enzymes NON COMPATIBLES au niveau des sites de restrictions. Exemple :

 

5' NNNNNNNGGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAATTCNNNNNNNNNN 3'
3' NNNNNNNCCTAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTTAAGNNNNNNNNNN 5'

 

5' GATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNG 3'
                  3'  GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTTAA 5'

 

5' GATC 3' ≠ 5' AATT 3'

 

Bords "libres" NON identiques = NON compatibles => pour s'insérer va devoir avoir complémentarité

ET comme c'est PAS pareil des deux cotés = peut s'orienter dans UN SEUL sens !!! (l'insert peut pas se "retourner")

Rappel : le plasmide est coupé par les mêmes enzymes => suivant "l'ordre" des sites de restrictions sur le plasmide, l'insert s'insérera dans un certain sens !

 

J'espère que tu as compris :)

 

Pour la PCR à queues flottantes, ça sert à rajouter des séquences sur ton insert (les séquences rajoutées sont sur la queue flottante, càd sur la partie des amorces qui s'hybrident pas avec l'insert à amplifier => c'est très souvent des sites de restriction qu'on rajoute, notamment pour faire du clonage après :)

 

Tu reverras ça en TP où ça devient plus concret et plus simple à comprendre

 

[Passensible]

Merci bcp pr ta réponse @emma-tie, je comprend mieux les diff orientations, mais juste je n’arrive pas à visualiser où l’insert se mettra au niveau de la séquence 

Il y a 4 heures, emma-tie a dit :

5' GATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNA 3'
                  3'  GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAG 5'

Par ex comment l’insert se positionne ici? En bas de 5’GATC? (Dans le brin du bas)? 

 

Merci bcpp!!

[emma-tie]

Il y a 14 heures, Passensible a dit :

Il y a 19 heures, emma-tie a dit :

5' GATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNA 3'
                  3'  GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAG 5'

Par ex comment l’insert se positionne ici? En bas de 5’GATC? (Dans le brin du bas)? 

Non, là ces deux brins d'ADN c'est ton insert (insert = séquence double brin). 

 

Pour t'aider à visualiser :

Pour rappel, on coupe le plasmide au niveau de son MCS, là où ya plein de sites de restriction dont les mêmes que sur l'insert (sinon pas d'intérêt à utiliser ce plasmide si ya pas les mêmes sites) ; ici on veut les mêmes sites parce qu'on à un insert à bords cohésifs et qu'il faut complémentarité pour l'insertion.

 

EXEMPLE : 

 

Plasmide (vecteur) : 5' NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'
                                      3'  NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCTAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNN 5'

 

Plasmide coupé :      5' NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNG                                                     GATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'
                                     3'  NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCTAG                                                     ANNNNNNNNNNNNNNNNNN 5'

 

 

Insert : 

5' NNNNNNNNNNNNGGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGATCTNNNNNNNNNNN 3'
3' NNNNNNNNNNNNCCTAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAGANNNNNNNNNNN 5'

 

Insert coupé :

5' GATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNA 3'
                   3' GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAG 5'

 

 

 

=> LIAISON :

                                    5' NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNG                                                     GATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'
                                   3'  NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCTAG                                                     ANNNNNNNNNNNNNNNNNN 5'

 

5' GATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNA 3'
                   3' GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAG 5'

 

Résultat : Ici on a deux enzymes compatibles : donc 2 sens d'insertion :

 

5' NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'

3' NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCTAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNN 5'

OU

5' NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'

3' NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCTAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNN 5'

 

 

Remarque : dans cette matière biomol, on utilise le clonage afin d'insérer des séquences codantes (contenant codon initiation ATG…), et avec un promoteur qui se trouve sur le plasmide dans un sens précis, ainsi il fait faire (dans ce contexte la) un clonage orienté afin d'avoir le codon ATG bien en "phase" avec le promoteur. EXEMPLE: 

 

5' NNNNN====>NNNNNNNNNNGGATCCNNNATGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'

      3' NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCTAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNN 5'

OU

 5' NNNNN====>NNNNNNNNNNNGGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'

  3' NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCTAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTANNTCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNN 5'

 

c'est le premier sens d'insertion qui permettre de produire le bon ARN qui pourra ensuite traduire la protéine

=> faut changer les sites de restriction de l'insert (et aussi coupé le plasmides avec les mêmes nouvelles enzymes)  pour passer à un clonage orienté avec des enzymes NON compatibles et ensuite avoir que le premier sens d'insertion

Edited September 11, 2025 by emma-tie