Western Blot

[Pala.off]

Coucouu est ce que qq pourrait me dire comment un western blot à partir d’un extrait de cellules permet de vérifier la production d’un protéine sécrétée ? 
On compte le surnageant aussi dans le western ? 
merci

[jlr.10]

Salut @Pala.off!

 

Oui, selon moi si tu sais que la protéine qui t’intéresse est une protéine sécrétée, tu va mettre tes cellules en culture et tu va récupérer le surnageant de culture qui contient tous ce qu’on sécrété les cellules. 
Et c’est sur ce surnageant que l’on va faire le WB : électrophorèse SDS-PAGE ; transfert sur filtre ; détection de la protéine d’intérêt avec un anticorps spécifique 

À la fin si tu détecte ta protéine d’intérêt sur le WB du surnageant alors c’est qu’elle est sécrétée. 
 

J’espère que c’est plus claire. N’hésite pas si tu as d’autres questions !

Bon courage ! 

[Pala.off]

il y a 10 minutes, jlr.10 a dit :

Salut @Pala.off!

 

Oui, selon moi si tu sais que la protéine qui t’intéresse est une protéine sécrétée, tu va mettre tes cellules en culture et tu va récupérer le surnageant de culture qui contient tous ce qu’on sécrété les cellules. 
Et c’est sur ce surnageant que l’on va faire le WB : électrophorèse SDS-PAGE ; transfert sur filtre ; détection de la protéine d’intérêt avec un anticorps spécifique 

À la fin si tu détecte ta protéine d’intérêt sur le WB du surnageant alors c’est qu’elle est sécrétée. 
 

J’espère que c’est plus claire. N’hésite pas si tu as d’autres questions !

Bon courage ! 

Coucou merci bcp pour ta réponse! 
oui j’ai une autre question mdr si ça te dérange pas par rapport aux questions: on peut utiliser les amorces « ..et.. » pour faire la RT-PCR (sur le plasmide par exemple) pour vérifier l’expression du gène. Ca marche que parce que c RT-PCR ou si y’avait que PCR ça marche quand même ? Pour moi si on met que PCR c faux nn on peut utiliser la PCR normale que pour vérifier que le gène est bien incorporé ? 
Merci

[dzinthesky]

Il y a 5 heures, Pala.off a dit :

Coucou merci bcp pour ta réponse! 
oui j’ai une autre question mdr si ça te dérange pas par rapport aux questions: on peut utiliser les amorces « ..et.. » pour faire la RT-PCR (sur le plasmide par exemple) pour vérifier l’expression du gène. Ca marche que parce que c RT-PCR ou si y’avait que PCR ça marche quand même ? Pour moi si on met que PCR c faux nn on peut utiliser la PCR normale que pour vérifier que le gène est bien incorporé ? 
Merci

Coucou ! Avec la RT PCR tu étudies de l'ARNm, et avec la PCR tu étudies l'ADN. Pour un gène inséré dans ton plasmide tu peux utiliser la RT PCR pour vérifier l'expression du gène en partant de l'ARNm produit qui sera converti en ADNc puis amplifié par PCR. Tu peux aussi utiliser une PCR normale pour vérifier la présence de l'ADN inséré dans le plasmide.

C'est plus clair?

Bon courage !!

[Pala.off]

Il y a 23 heures, dzinthesky a dit :

Coucou ! Avec la RT PCR tu étudies de l'ARNm, et avec la PCR tu étudies l'ADN. Pour un gène inséré dans ton plasmide tu peux utiliser la RT PCR pour vérifier l'expression du gène en partant de l'ARNm produit qui sera converti en ADNc puis amplifié par PCR. Tu peux aussi utiliser une PCR normale pour vérifier la présence de l'ADN inséré dans le plasmide.

C'est plus clair?

Bon courage !!

Merci pour ta réponse ! Si j’ai bien compris par on peut regarder si y’a eu expression avec PCR et RT PCR?

[dzinthesky]

il y a 10 minutes, Pala.off a dit :

Merci pour ta réponse ! Si j’ai bien compris par on peut regarder si y’a eu expression avec PCR et RT PCR?

Avec la RT PCR tu étudies l'ARNm, donc t'auras une idée sur l'activité transcriptionnelle. Avec la PCR tu regardes l'ADN donc l'expression du gène.

C'est plus clair ?

Bon courage pour cette dernière ligne droite !!