cours du tut pour études des prot ?

[MileyVirus]

Bonjouur, j'ai l'habitude d'utilisé les cours dans les drives pour réviser mais ceux sur la recherche de prot sont hyyyper long, est-ce que quelqu'un pet me dire si les cours du tut sont suffisant ? parce que je sais que c'est pas la même prof (d'ailleurs petite pensée à cette malheureuse dame...) et j'ai peur de louper quelques infos... et donc je sais que les cours du tut sont cool donc voilà

merci et bonne fin de journée !

[Sckamaar]

il y a 39 minutes, MileyVirus a dit :

Bonjouur, j'ai l'habitude d'utilisé les cours dans les drives pour réviser mais ceux sur la recherche de prot sont hyyyper long, est-ce que quelqu'un pet me dire si les cours du tut sont suffisant ? parce que je sais que c'est pas la même prof (d'ailleurs petite pensée à cette malheureuse dame...) et j'ai peur de louper quelques infos... et donc je sais que les cours du tut sont cool donc voilà

merci et bonne fin de journée !

Salut, étant donner que c’est un nouveau prof cette année, à mon avis tu devrais travailler avec ses cours car ils seront forcément différent étant donné que les drives et les cours écrit du tat correspondent à l’année dernière. Je pense que tu devrais travailler avec ses diapos et annoté. J’espère avoir pu t’aider.

[MileyVirus]

à l’instant, Sckamaar a dit :

Salut, étant donner que c’est un nouveau prof cette année, à mon avis tu devrais travailler avec ses cours car ils seront forcément différent étant donné que les drives et les cours écrit du tat correspondent à l’année dernière. Je pense que tu devrais travailler avec ses diapos et annoté. J’espère avoir pu t’aider.

mincee je vais pas en CM donc j'ai pas de notes, ecoute merci quand meme, jvais quand meme faire le minimum en prenant ses diapo !!

[Aaronigashima]

13 minutes ago, MileyVirus said:

mincee je vais pas en CM donc j'ai pas de notes, ecoute merci quand meme, jvais quand meme faire le minimum en prenant ses diapo !!

Au cas ou, je te met mon cours de l'année dernière qui, je le trouve, n'est pas si long que ca et est censé reprendre toutes les informations de l'année dernière (pas cette année attention, celles de l'an dernier) : 

Spoiler

Etude du proteome : etude des prot dans un contexte donne a un instant t dans un organisme, cellule, ou un tissu ou un liquide donne

→ varie en fonction de la nature des prot, structure, localisation, modification post trad, interactions...

 

Analyse genetique classique : organisme mutant ou malade (en comparant avec sauvage) → identification du gene dans pathologie (clonage, sequencage etc) → proteine purifiee (pour analyses) → conception composes actifs

Analyse inverse : proteine purifiee → identification du gene (clonage etc) → inactivation ou surexpression du gene → consequences sur organisme (apparition pathologie?) → fonction prot de depart → conception medoc

 

Partie 1 : purification des prot = prot isolee dans conformation native (en etat de fonctionner) avec haut degre purete (= pas d'autres pro) et un bon rendement (le min de reactifs pour max de produits)

Pb : elles ont des ptés physico-chimiques tres proches

Purification directe a partie d'une source biologique qui contient la prot, ou apres surexpression de la prot dans systeme d'expression (prot recombinantes)

 

Partie 1A : extraction des proteines :

Materiel de depart : organes, tissus, cellules → tampon de lyse (broyer, eclater) → homogenat (puree) puis extrait brut = cellules lysees

Si deja dans liquide biologique ou surnageant → filtration et concentration → solution concentree

==> prot solubles

 

Tampon de lyse → centrifugation → proteine d'interet dans fraction soluble

Travailler a 4°C (car aucune activite enzymatique), tampon de lyse contient solution tampon (pH a peu pres = 7), sels, antioxydants, antiproteases et phosphatases, Dnases, (detergent)

+ lyse mecanique (on broie a la machine), enzymatique, ou chimique => facultatif

 

Cas particulier 1 : prot est dans compartiment cellulaire particulier :

on simplifie en purifiant le compartiment et eliminer toutes les autres → centrifugation differentielle (ou fractionnement CR) → comme pour les lipides

Ex prot nucleaire : tampon de lyse preservant integrite noyau, obtention homogenat, purification noyaux par fractionnement, tampon de lyse qui solubilise noyau → extrait nucleaire

 

Cas particulier 2 : quand il est possible de concentrer prot d'interet

=> precipitation (perte de structure donc elimination facile)

Dans plasma → sels d'amonium → precipitation de toutes les prot sauf albumine → centrifugation avec albumine soluble => extrait de la prot d'interet

 

Partie 1B : chromatographie (purification)

On a prot isolee dans sa conformation native etc : extrait brut → fraction purifiee

Phase mobile traverse support et stationnaire (support qui sert a retenir les prot → echange d'ions, affinite, hydrophobie etc)

Pour faire decrocher prot → solution de lavage qui decroche les prot avec une certaine affinité (fraction non retenue) puis a un moment on met solution d'elution pour recuperer prot d'interet

 

chromatogramme : Absorbance (DO280nm) = f(temps ou volume)

→ pic d'absorbance lors de la solution d'elution → presence prot d'interet (courbe correspond a charge => soit charge (echange d'ions), taille (gel = exclusion), liaison (affinité), polarite

Echangeuse d'ions :

Si pI < pH => charge - , sinon charge +

→ donc il faut des supports charges (les colonnes + accrochent les prot - => echangeuses d'anions)

Elution avec du sel ou en changeant pH

 

Chromatographie d'exclusion :

En fonction de la taille/forme (masse moleculaire) => petites prot passent partout, les grosses passent par le plus court chemin => les grossent migrent plus vite

Chromatogramme → pas la charge

Volume mort (v0) → les plus grosses molecules = volume entre les pores de la colonne

Chaque pic = volume d'elution

Determination masse moleculaire : on connait masse plusieurs prot : on les met dans colonne et on regarde volume d'elution/volume mort => on trace une courbe (plus c'est en bas de la courbe plus c lourd)

→ on peut determiner masse molaire prot inconnue avec cette courbe par lecture graphique

Pour desaler solution : sel est tout petit et prot c gros → absorbance prot a 280 nm => prot sort en premier et les sels restent dans pores => sortent separement

 

Chromato d'affinite :

Matrice avec une affinité avec prot (mais reversible sinon ca sert a rien → pas de covalence)

Exemple : si on veut purifier antigene → anticorps sur matrice (elution par diminution pH), si on veut enzyme on met substrat, pour recepteur on met hormone, prot GST on met gluthation (elution au gluthation aussi), metal avec his (elution a l'imidazol)...

Elution avec modification force ionique (modification [sels]) OU pH, affinite competitive plus forte avec ligand ou avec prot (selon celui qu'on veut → si on veut prot on met sur ligand)

 

Partie 1C : application aux prot recombinantes

Prot produites par organisme qui ne les produit pas naturellement => contrôle qualite et qté des prot produites → utile pour therapeutique (insuline, HGH, anticorps et antigenes...)

Purification apres surexpression par vecteurs viraux (voir cours Bettina Couderc) → prot en vrac → medoc

Prot purifiee → utilisation directe, ou etudes structurale, ou obtention d'outils

 

Profil proteique : electrophorese, presente : western blot, localisation : immunomarquage et prot etiquetees, secretee : ELISA, fonction/domaines importants : genie genetique, partenaires : pull down et precipitation