Passensible Posted January 26 Posted January 26 (edited) Bonsoir, désolée en avance pr mes 4000 qsts J'ai BEAUCOUP de mal avec les calculs en recherch (et pas que)... Je n'y arrive pas et je comprend absolument pas la logique (mis à part calculer la taille du plasmide recombinant,...) ou meme connaitre les positions des enzymes intermediaires apres l'ajout de l'insert! Voici un ex de qcm sur la plateforme où je ne comprend pas: https://zupimages.net/viewer.php?id=25/04/lkqa.png / https://zupimages.net/viewer.php?id=25/04/b8lh.png / https://zupimages.net/viewer.php?id=25/04/bypb.png Tout d'abord pr le A, j'avais mis faux pr le kpb mais aussi parce que j'étais pas d'acc avec le nombre 3530 pb, j'avais trouvé 3930 pb (2,2 kpb + la distance entre Hind 1 et Hind 2 = 2,2 kpb + 1730 pb = 3930 pb). Le B je ne comprend vrm vrm pas . Et je suis pas sure de comprendre la C non plus ... Aussi, pr ce qcm: je ne comprend pas cet item est compté vrai "Après digestion des deux plasmides pGENE et pPASS par EcoR1 et Xho1 et insertion du fragment libéré par pGENE dans pPASS, on obtient un plasmide recombinant de 2985 pb" J'avais compté la distance entre Ecori et xho dans pGENE (1960-1150= 810 pb: meme si je ne comprend pas pq ecori a une position qui est superieur à la taille du plasmide pGENE même...) puis j'ai ajouté ce 810 aux 3700 pb de l'autre plasmide Aussi, dans ce qcm: L’insuline est une hormone constituée de 2 chaînes polypeptidiques reliées par deux ponts disulfures. Elle contient également un troisième pont disulfure dans la chaîne A. Cette chaîne, constituée de 21 acides aminés, est reliée à la chaîne B, une formation de 30 acides aminés. Elle est produite dans le corps humain par les cellules bêta des îlots de Langerhans. Physiologiquement, elle contrôle la glycémie en stimulant la conversion des glucides en acide gras, et en bloquant la production de glucose dans le foie. Elle permet donc d’éviter les situations d’hyperglycémies. Chez les patients diabétiques, la production d’insuline est ralentie voire stoppée, et ils nécessitent donc un apport exogène en cette hormone. Une équipe de chercheurs essaie de créer des organismes sécrétant de l’insuline, afin de récolter l’hormone pour traiter des patients diabétiques. Ils disposent du plasmide ci-dessous et d’un gène linéarisé. On note que l’ADNc de l’insuline comporte une séquence permettant la sécrétion de l’hormone. -> Pq on considère que cet item est vrai: Pour obtenir un plasmide recombinant exprimant le gène de la résistance à l’ampicilline chez les procaryotes, on peut digérer le plasmide pINSULINE avec la cassette d’expression linéarisée, BamH1 et HindIII. Pour moi c'était pas possible car le promoteur se trouvant juste avant l'ADNc du gène codant pr la résistance à l'ampiciline est eucaryote constitutif donc je comprenais pas trop. Merci bcp d'avance et désolée du dérangement! Edited January 26 by Passensible Quote
Tuteur PetiteComète Posted January 27 Tuteur Posted January 27 (edited) Coucou @Passensible ! Pour le premier QCM, je n'arrive pas à lire les infos sur les schémas (notamment le plasmide) tu pourrais envoyer une image plus nette ou bien me dire d'ou provient ce qcm ? Merci Edited January 27 by PetiteComète Fodiliaque 1 Quote
Tuteur Solution PetiteComète Posted January 27 Tuteur Solution Posted January 27 (edited) Pour ce qui est du 2eme QCM : Pour ton item qui te pose probleme : Après digestion des deux plasmides pGENE et pPASS par EcoR1 et Xho1 et insertion du fragment libéré par pGENE dans pPASS, on obtient un plasmide recombinant de 2985 pb" Je vais prendre chacun des plamside et les digérer avec les enzymes indiquées : - pPASS : mon plasmide fait 3700pb au total, je coupe à un site à 1925pb et au niveau d'un site à 400pb : en effet on te dit bien qu'on digère les deux plasmides, docn celui ci aussi !! En effet comment tu vas insérer un élément dedans si tu ne l'ouvre pas ? J'obtient donc 2 morceaux (puisque je coupe en 2 endroits) *un mini morceau de : 1925-400 = 1525pb. Ce morceau ne m'interesse pas (car il ne contient pas oriet qu'il ne continet pas non plus notre gène) *un grand morceau de : total plasmide - le mini morceau = 3700 - 1525 = 2175pb. Ce morceau nous interesse : c'est donc la taille du plasmide pPASS après digestion ! -pGENE : mon plasmide fait 1900pb au total, je coupe à nouveau aux sites de restrictions des deux enzymes, les sites sont au niveau de 960pb et au niveau de 150pb. A nouveau j'obtient 2 morceaux : *un mini morceau de : 960 - 150 = 810pb. C'est lui qui contient le gène donc ces't lui que l'on garde ! *un autre grand morceau (inutil de le calculer) - Plasmide recombinant : c'est la somme des deux morceaux "qui nous interessent" : le grand morceau de pPASS + le petit morceau de pGENE = 2175 + 810 = 2985pb Edited January 27 by PetiteComète dzinthesky, Passensible and Fodiliaque 1 1 1 Quote
Passensible Posted January 27 Author Posted January 27 (edited) coucou @PetiteComète, le premier qcm c'est le qcm 6 sur la plateforme! Voici le qcm en plus clair: / Edited January 27 by Passensible PetiteComète 1 Quote
Tuteur PetiteComète Posted January 27 Tuteur Posted January 27 (edited) 3eme QCM: Tu vas voir c'est tout simple : Lorsque tu observes ton plasmine et que tu regardes le gène qui code la résistance à l'ampicilline, tu constates qu'en amont de ce gene se trouve un promoteur eucaryote constitutif. Le but des chercheurs ici est de remplacer ce promoteur : pour se faire il faut retirer le promoteur existant et en ajouter un nouveau. Lorsque tu regardes ta cassette d'expression linéarisée, tu constates qu'elle contient un promoteur procaryote constitutif. Il est donc parfait pour remplacer l'autre promoteur qui se trouve dans ton plasmide ! Dans ces circonstances il faut donc retirer les deux promoteurs pour les intervertir. Pour cela tu as besoin d'enzymes de digestion. On te les propose ici : il s'agit de Bam H1 et de Hind 3 Tu regardes donc dans un premier temps si c'est deux enzymes sont bien présentes et tu verifie qu'elles encadrent bien tes promoteurs à la fois au sein du plasmide et à la fois au sein de ta cassette d'expression Tu regardes aussi leur localisation car il faut que le promoteur, soit la flèche, aille dans le bon sens c'est-à-dire en direction de ton gène. Ainsi parmi tes deux sites de restrictions tu constates que au sein du plasmide le site de restriction qui est entre le promoteur et ton gène de résistance à lampicilline est Hind 3. Et tu regardes ta cassette d'expression et tu vois que le promoteur va en direction de ton site hind3. Donc les deux sites cités sont bien présent dans ces deux éléments, ils encadrent chacun de tes promoteurs, et cela dans le bon sens ce qui signifie que la transcription du gène de résistance à lampicilline est possible et que la traduction ensuite de ta protéine sera possible. Edited January 27 by PetiteComète Fodiliaque, dzinthesky and Passensible 1 2 Quote
Tuteur PetiteComète Posted January 27 Tuteur Posted January 27 Par rapport à ton probleme, je reclarifie : N'importe quel promoteur peut-être placé devant n'importe quel gène, il n'y a pas de généralité c'est un choix que les chercheurs peuvent faire En fait la nature de ton promoteur ne va pas changer le type de la protéine, elle sera transcrite et traduite de la même façon. Le type de promoteur te sert simplement à savoir dans quel organisme ta protéine est traduit. Si ton organisme est procaryote comme la bactérie par exemple alors si tu veux faire exprimer ton gène de résistance à l'ampicilline il te faut un promoteur procaryote. Si tu as un organisme eucaryote comme la souris, là il te faudra un promteur eucaryote. Une fois que tu as compris ça tu comprends que cette histoire de promoteur n'est pas si compliqué. C'est un item qui tombe souvent à l'examen sous forme de piege, cest donc des points faciles pour le concours Fodiliaque and dzinthesky 1 1 Quote
Tuteur PetiteComète Posted January 27 Tuteur Posted January 27 (edited) Oh c'est parfait merci pour l'image tu me fais gagner un temps fou !! Tu vas voir la réponse est longue mais tu as tout dessus donc courage ITEM A : taille du plasmide recombinant. C'est à dire le plasmide de base de 2 200 pb digéré par HindIII et l'insert contenant les différents gènes et promoteur encadrée par HindIII. - D'une part le plasmide : Tu as 2 sites de restriction HindIII : un en 1000 et un en 1400. Ainsi lorsque tu digères tu obtiens 2 morceaux : * un petit de 400pb (1400 - 1000) * un grande 2 200 - 400 = 1800 pb. => c'est lui qui nous interesse car il contient l'ORI. -D'autre part la cassette d'expression : Tu as à nouveaux deux site, ici on va considéré que tu obtient qu'un morceau dont la taille correspond à la distance entre les 2 sites HindIII qui sont à 1800 pour (2) et 70 pour (1) soit : 1800 - 70 = 1730pb => ceci correspond à ton insert ! -Et donc ton plasmide recombinant : 1800 + 1730 = 3530pb. J'ajoute que le clonage est non orienté puisque tu as deux fois la même enzyme : HindIII. ITEM B : On doit donc prendee notre plasmide recombinant ainsi obtenue juste au dessus et on le digère par Pcil. Ensuite on regarde les morceaux obtenus. PREMIERE CHOSE, *ON REGARDE NOTRE PLASMIDE RECOMBINANT *ON NUMEROTE *ON CHERCHE NOTAMMENT LES LOCALISATION DES SITES Pcil (le reste ne nous interesse pas) !!! (tu peux faire sous forme de shcéma ou laisser sous forme de texte, c'est comme tu le sens) n°1 : Il y a un site Pcil à 200 sur ce qui etait notre ainsi plasmide. Il est toujours présent dans notre plasmide recombinant en même position. n°2 : Il y a un autre site Pcil à 1200 qui etait sur notre insert. Il est après en présent dans notre plasmide recombinant. Pour rappelle au sujet de la cassette d'expression : *on a coupé en HindIII (1) à 70 (qui devient donc 0) *le site Pcil se trouve à 1200 (qui devient donc 1200 - 70 = 1130) *on a recoupé en HindIII (2) à 1800. (qui devient donc 1800 -70 = 1730) Une fois digéré, tu obtient donc ton fragement qui débute donc à HindIII, qui devient donc ton zéro : je fais de même en changeant la numérotation pour mes 3 points (je te mets ca en rouge juste au dessus) => c'est la numérotation sur l'insert En faisant cela tu constate que ton site Pcil n'est pas au centre de ton insert (1130 est différent de 865 qui correspondrait à la moitié de ton frangement) Tu te rappelle que tu avais un clonnage non orienté, donc tu a conscience que l'insert peu se mettre dans les deux sens. Ainsi pour ce qui est de la numérotation dans la plasmide recombinant, il faut refaire des calculs, puisqu'il y a 2 options, je te met ca en dessous : OPTION 1 : *HindIII (1)prend la place du HindIII qui etait sur le plasmide à 1000 => 1000 *le site Pcil se trouve à 1000 + 1130 => 2130 *HindIII (2) se retrouve donc à 1000 + 1730 => 2730. OPTION 2 : *HindIII (2) prend la place du HindIII qui etait sur le plasmide à 1000 => 1000 *le site Pcil est toujours plus proche de HindIII (2), il en est éloigné de : distance HindIII (2) et Pcil = 1730 - 1130 = 600. Ainsi, sa position est : 100 + 600 => 1600 *HindIII (1) se retrouve donc à 1000 + 1730 => 2730. Donc au niveau des Pcil repérés : > la position 200 est occupée par un site Pcil (elle était présente dans ton plasmide de base) => cf n°1 plus haut. > un autre site Pcil est présent dans ton plasmide recombinant mais il peut avoir 2 position selon le sens d'insertion : 2130 ou 1600 DEUXIEME CHOSE, ON COUPE AU NIVEAU DES DEUX LIEUX 2 propositions, une pour chaque type de plasmide recombinant formé : => on coupe en 200pb et en 2130 pb => on coupe en 200pb et en 1600. Proposition 1 : on coupe en 200pb et en 2130 pb. On obtient 2 morceaux : *un de 2130 - 200 = 1930pb *un de taille: plasmide recombinant - 1930 = 3530pb - 1930 = 1600pb Proposition 2 : on coupe en 200pb et en 1600pb. On obtient 2 morceaux : * un de 1600- 200 = 1400pb * un autre de 3530 - 1400 = 2130 pb TROISIEME CHOSE, L'ITEM : On te propose 2 bandes à 1930 et 1600, ca correspondons à ta proposition 1 au niveau du sens. Mais rien n'est jamais parfait et lors d'un clonnage orienté c'est une chance sur 2 pour l'insertion, il est donc pas normale de ne pas avoir la Proposition 2 qui elle révèle des bandes à 1400 et 2130 pb : on est donc supposés avoir ces 4 bandes ! ITEM C : On cherche à sélectionner les plasmides recombinants, qu'importe le sens d'insertion de l'insert, on veut juste qu'il soit là et qu'il n'y ait que eux. On te parle de les mettre dans un milieu en présence d'ampicilline et sans glucose. Qui survie ? Ceux qui sont résistant à l'ampicilline et donc qui portent ce gène. Ce gène est présent dans ton plasmide de base et cette partie n'a pas été enlevée dans ton plasmide recombinant. Donc les deux vont pouvoir l'exprimer (en présence de glucose car c'est un promoteur inductible, cf consigne). Mais donc ca ne te permet pas de faire la différence. Il aurait fallu utiliser un gène qui est présent que dans l'insert et donc par exemple tester dans ce cas la la résistance à la vancomycine. VOILA ! J'ai essayé de tout détailler un max pour que tu comprennes bien ! Dis moi si tu as des questions sur toutes mes réponses De plus si tu vois que ceci n'est pas claire du tout pour toi tu peux te rendre à la formation du 29 janvier ou bien en permanence le jeudi de 12h à 13H30. Edited January 27 by PetiteComète Passensible, dzinthesky and Fodiliaque 1 1 1 Quote
Passensible Posted February 1 Author Posted February 1 Merci bcppppp @PetiteComète! C'est nettement plus clair maintenant! PetiteComète 1 Quote
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