Taille plasmide recombinant

[Atlas]

 

QCM 2 - Afin d’étudier les propriétés anti-tumorales du gène c2S30-01, une équipe de chercheurs décide de créer un modèle animal en transduisant ce gène dans les cellules tumorales d’une lignée de rat. Pour cela, ils disposent de deux plasmides : pGÈNE et pPASS. Ils possèdent également une variété d’enzymes de restriction permettant d’ouvrir ces deux plasmides. Malheureusement, Stan, un éminent chercheur de l’équipe, a effacé par mégarde le mode de fabrication du plasmide recombinant. On sait que les enzymes de restriction Pst1, HindIII, EcoR1 et Xho1 ne sont pas compatibles. Indiquez si les propositions suivantes sont vraies ou fausses : 

A. On digère pGENE et pPASS avec Pst1 et HindIII. En tenant compte de l’objectif des chercheurs, ils peuvent utiliser le plasmide résultant. 

VRAI

FAUX

 

B. On digère pGENE et pPASS avec EcoR1 et HindIII. En tenant compte de l’objectif des chercheurs, ils peuvent utiliser le plasmide résultant. 

VRAI

FAUX

 

C. Après digestion des deux plasmides pGENE et pPASS par EcoR1 et Xho1 et insertion du fragment libéré par pGENE dans pPASS, on obtient un plasmide recombinant de 2985 pb. 

VRAI

FAUX

 

D. On digère pGENE et pPASS avec Pst1 et Xho1, le plasmide résultant permet de transcrire le gène c2S30-01. 

VRAI

FAUX

 

E. On commence par digérer les deux plasmides avec BamH1 et Mbo, puis on insère le fragment libéré par pGENE dans pPASS, après le processus de ligation, on obtient un plasmide recombinant. La digestion de ce plasmide recombinant ayant inséré le fragment d'intérêt par HindIII libérera 2 fragments de restriction. 

VRAI

Bonjour, j’ai fais un copier copier coller d’un qcm de la plateforme de Tutoweb, qui est sur le meme thème que celui ci, pour pouvoir avoir une correction détaillée car elle n’est pas très détaillée ou alors je comprend pas assez …

J’arrive pas trop a savoir comment un couple d’enzyme de restriction pourrait correspondre a ce qu’on veut et ensuite quand je dois compte les paires de base je me trompe pourtant j’ai l’impression d’appliquer la meme méthode..

Les réponses vraies sont : C et E 

Merci beaucoup ! 

[PetiteComète]

Coucou, Alors alors, je vais essayer de t'expliquer ici de la facon la plus claire possible, néanmoins c'est quelque chose de très visuelle donc si tu vois que ce problème persiste, je t'invite à aller en permanence le jour J ou bien à aller à la formation du 29 Janvier 

 

Item A :

 

Donc, tu regardes tes deux plasmides et tu regarde où sont les sites de restrictions Pst1 et HindIII.

 

Première chose combien il y a de site de chaque type sur chaque plasmide.

Ici il y a sur pGENE : un site Pst1 et un site HindIII

Et il y a sur pPASS : un site Pst1 et un site HindIII

 

Deuxième chose, tu visualises que tu coupes à ses 4 endroits.

 

Pour pPASS tu obtiens 2 morceaux :

* un plus petit qui contient le site ORI

* un plus grand qui continent le reste de ton plasmide

Pour pGENE tu obtient aussi 2 morceaux :

*un qui continent ton gène d'intérêt c2S30-01 => celui qui nous intéresse car le but c'est de "déplacer" ce fameux gène

* un plus grand

 

Si tu visualises insérer le petit fragment issu de pGENE qui continent ton gène d'interet c2S30-01 dans un des deux autres fragment de pPASS, tu constate que ce n'est pas possible  :

Avec le plus petit qui contient le site ORI tu n'as ni de promoteur ni de terminateur 

Avec le plus grand tu n'as pas de site ORI et donc impossible de transcrire ! 

Donc FAUX (pas la peine de faire la suite !)

 

Item B : 

Tu refais la même méthode qu'au dessus avec les 3 ETAPES : 

1/ combien de fois j'ai mon site sur chaque plasmide. 

2/ je visualise que je coupe 

3/ je visualise que j'emboite. 

 

Alors ici tu obtient en étape 2 un morceau de pGENE qui contient ton gène, le morceau fait : " promoteur procaryote + gène" 

De l'autre coté ton plasmide pPASS libère après digestion un grand morceau qui nous interesse (car il contient le site ORI)

Tu visualise donc, tu "colles" les deux lieux de coupure aux bons endroits soit : HindIII avec HindIII et EcoRI avec EcoRI (là pas de problème car c'est dans la même "orientation") 

Tu constate alors que tu as une suite : " promoteur procaryote + gène + terminateur"  Donc tout semble parfait MAIS NON car ton promoteur est PROCARYOTE, or ce plasmide va etre transfecté à une souris qui est EUCARYOTE. 

Donc FAUX (en soit on pouvait le voir des ma première ligne, mais j'ai voulu développer pour que tu comprennes bien.)

 

Item C : 

Les calculs...  tu vas voir c'est pas si dur !! 

Deja, les etapes 

1/ combien de fois j'ai mon site sur chaque plasmide. 

2/ je visualise que je coupe 

3/ je visualise que j'emboite.

 

- pPASS : je coupe aux deux sites indiqués : mon plasmide fait 3700pb au total, je coupe à un site à 1925 et au niveau d'un site à 400pb. J'obtient donc un mini morceau de 1925-400 = 1525. Ce morceaux ne m'interesse pas, je cherche la taille du reste : 3700 - 1525 = 2175pb : voila donc la taille du plasmide pPASS après digestion ! 

 

- pGENE : je coupe à nouveau aux sites de restrictions des deux enzymes, les sites sont au niveau de 960pb et au niveau de 150pb. Au total mon mini morceaux est de : 960 - 150 = 810pb. C'est lui qui contient le gène donc pas la peine de calculer la taille du grand morceaux. 

 

- Plasmide recombinant : le grand morceau de pPASS + le petit morceau de pGENE = 2175 + 810 = 2985pb 

Donc item VRAI 

 

Item D : 

 

Les etapes : 

1/ un seul site Pst1 sur chaque plasmide (de meme pour Xho1) 

2/ je visualise que je coupe : j'obtient 4 morceaux, la morceaux de pGENE qui contient mon gène et un terminateur ! 

3/ je visualise que j'emboite : mais attention à l'orientation, tu doit "retourner" ton fragment contenant le gène. En gros tu pose le coté Pst1 du fragment pGENE sur Pst1 du fragment pPASS. et tu fais de meme pour Xho1. 

Ensuite tu cherches ton premier PROMOTEUR en avant de ton gène. Tu vois donc "promoteur eucaryote consitutif" (super) puis "gene de resistance à l'ampicilline" (ok) et ensuite problème : "Terminateur" !! Le fameux terminateur qui vient d'etre inséré et qui donc provient de pGENE. Donc tu n'as pas de promoteur dispo pour ton gène ! 

Donc FAUX 

 

Item E : 

Bon, tu fait à nouveau tes étapes : 

1/ combien de fois j'ai mon site sur chaque plasmide. 

2/ je visualise que je coupe 

3/ je visualise que j'emboite. 

Là pas de problème tu as un promoteur interessant qui est bien EUCARYOTE et tu as un terminateur qui suivait le gène, le tout est bien orienté : parfait. 

Dans le fragment issu de pGENE que tu as intégré tu as : "gène + site de HindIII + terminateur" 

Donc une fois ton plasmide recombinant fait, ils te demandent de couper en HindIII. 

Tu as combien de sites HindIII sur ton plasmide RECOMBINANT ? 2 ! Un etait deja sur pPASS et l'autre à été inséré avec le gène. 

Donc si tu coupes ton plasmide en 2 endroits, tu obtiens bien 2 morceaux. 

Ainsi, l'item E est VRAI 

 

Donc bilan pour ce type de QCM : 

Tu fais les 3 étapes que  j'ai citées. 

Pour ce qui est de l'insertion tu fais attention à l'orientation !

Puis tu vérifie dans ton plasmide recombinant : 

- la présence du site ORI

- la présence d'un promoteur et du bon ! 

- la présence d'un terminateur 

(je ne dis pas la présence de ton gène d'interet mais ça parait logique )

 

Voila pour la correction détaillée, j'espere que ça t'a aidé et que ça a répondu aux autres questions que tu avais, si ce n'est pas le cas tu peux continuer à me pauser des questions ici ou bien venir en perm/ formation pour que l'on t'y réponde de vive voix !!

 

Bon courage, tu vas voir que la recherche ça peut devenir une vraie passion 

 

Edited January 23 by PetiteComète