Emmascapula Posted January 8 Posted January 8 Bonjour, je ne comprends pas vraiment comment peut on déduire à l’aide du plasmide si l’insertion est orientée ou non ? Dans de nombreux QCM du TAT on nous parle aussi de plasmide digéré ? Pourriez vous m’expliquer aussi cet aspect ? merci bcp ! Quote
yrr Posted January 8 Posted January 8 il y a 36 minutes, emma.salvan24 a dit : Bonjour, je ne comprends pas vraiment comment peut on déduire à l’aide du plasmide si l’insertion est orientée ou non ? Dans de nombreux QCM du TAT on nous parle aussi de plasmide digéré ? Pourriez vous m’expliquer aussi cet aspect ? merci bcp ! Bonjour, En attendant la reponse plus complete des tuteurs, je te propose la mienne. Alors pour moi l'etape de digestion d'un plasmide, c'est quand tu "coupes" un vecteur de ton plasmide à l'aide d'une ou plusieurs enzyme de restriction. Pour savoir si c'est orienté ou pas: Clonage non orienté : Utilisation d’une seule et même enzyme de restriction (ou de deux enzymes de restriction complémentaires) pour digérer le plasmide contenant la séquence d’intérêt et pour ouvrir le plasmide vecteur. La séquence va alors s’orienter dans n’importe quel sens : soit le codon initiateur ATG est situé du même côté que le promoteur (la transcription et la traduction seront possibles), soit le codon STOP est situé du même côté que le promoteur (la transcription sera possible mais la traduction sera impossible). Clonage orienté : Utilisation de 2 enzymes de restriction différentes et non complémentaires pour digérer le plasmide contenant la séquence d’intérêt et pour ouvrir le plasmide vecteur. La séquence va alors s’orienter dans un unique sens lors de l’intégration, puisque l’extrémité de la séquence clivée par l’enzyme 1 va s’intégrer dans le plasmide au niveau de la coupure effectuée par l’enzyme 1. Perso ce que je faisais, c'est que si dans l'enoncé je voyais qu'on me parlait de 2 enzymes alors je disais qu'il etait orienté et si y en avait qu'une seule alors non-orienté. Je laisse les autres completer/corriger Bon courage! Loïstamine 1 Quote
Ancien Responsable Matière Solution Fodiliaque Posted January 8 Ancien Responsable Matière Solution Posted January 8 Il y a 4 heures, emma.salvan24 a dit : Bonjour, je ne comprends pas vraiment comment peut on déduire à l’aide du plasmide si l’insertion est orientée ou non ? Dans de nombreux QCM du TAT on nous parle aussi de plasmide digéré ? Pourriez vous m’expliquer aussi cet aspect ? merci bcp ! En effet, comme a pu le dire @yrr tu va pouvoir en premier lieu utiliser des enzymes de restriction afin de digérer ton plasmide et d'obtenir le vecteur dont tu as besoin. C'est ces enzymes de restrictions qui vont permettre de définir ton orientation. Imaginons que tu prennes 2 enzymes de restrictions différentes, elles vont forcément couper à deux endroits précis, permettant ainsi au vecteur de s'insérer dans un sens précis (l'enzyme 1 coupe à tel nb de pdb et pareil pour la seconde). Ces deux coupures permettent en fait de créer deux "sites" uniques où le vecteur va s'orienter par complémentarité. Tandis que si tu ne prend qu'une enzyme de restriction, alors le brin pourra s'orienter "au hasard" dans une des deux directions dans le plasmide. Etant donné que les extrémités sont toutes deux compatibles (car les mêmes). On a donc un ratio de 50%. On dira alors que le son insertion est non orienté (l'orientation étant défini par le ratio). (par ailleurs si les extrémités ne sont pas du tout compatible entre le plasmide et le brin, ce dernier ne s'intégrera pas) dzinthesky, Loïstamine and Paulimère 1 1 1 Quote
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