BMC 1- Sélection d'enzymes de restriction

[Mehdicalement]

Bonjour, 

J'aimerais comprendre pourquoi dans le cadre de ce clonage orienté, dans la question n°4 on digère le plasmide BAMH1 et Sac 1, je ne comprends pas on ne digère pas le plasmide par BglII et Sac 1 comme précédemment. 
De plus, il est indiqué que la séquence du site de restriction de BAMH1 est localisé dans l'insert.

https://zupimages.net/viewer.php?id=24/44/5ax0.png

https://zupimages.net/viewer.php?id=24/44/5d78.png

[WhalesInTheSky]

Salut, 

 

Pour la question 4, on veut orienter le fragment dans l'autre sens (côté promoteur T7) comparé aux questions précédentes où c'était du côté T3.

 

On garde le fragment de PCR donc on digère avec BGIII et SacI (c'est ce qui est écrit dans l'énoncé). Ici, on n'utilise pas BamHI car comme tu l'as dit il est présent dans l'insert donc dans la partie d'ADN qui nous intéresse. 

 

Ensuite on va digérer le plasmide. 

Le but c'est de mettre le fragment dans l'autre sens.

BamHI et BgIII sont compatibles c'est-à-dire qu'un site BGIII qui a été digéré, en se reformant, peut se reformer avec une partie de site BamH1. C'est cette propriété que tu vas utiliser pour répondre à la question. 

Ainsi la partie de site BamHI du plasmide va se reformer avec la partie de site BGIII du fragment. Les parties de SacI se reforme entre elles de leur côté . 

Sur la figure 1, tu vois que BgIII est du côté du promoteur T3, SacI à peu près au milieu et BamHI du côté du promoteur T7. 

Ainsi, couper le plasmide avec BamHI et SacI permet de l'orienter du côté T7. C'est pour cela que l'on choisit ces deux enzymes de restriction pour le plasmide. 

 

J'espère que ça t'aide. 

Bonne soirée et bon courage.