Action de l'ADN ligase

[Oberyn]

Salut salut

 

J'aurai besoin de petites précisions en ce qui concerne les sites de restriction et l'action de la ligase car je ne pense pas avoir les idées très claires avec ces trucs là ..

En fait l'ADN ligase permet de relier n'importe quelles extrémités, qu'elles soient compatibles ou non? 

Et les extrémités qui sont compatibles entre elles peuvent se refermer toutes seules, sans l'action de la ligase ?

 

Merci d'avance.

[victorw]

Salut, la ligase ne peut fermer que les extrémités compatibles et les extrémités compatibles ne peuvent être refermées que s'il y a de la ligase. De plus, la ligase ne peut relier des fragments dont les extrémités 5' P sortantes ont été déphosphorylées. J'espère avoir répondu à ta question

[Felgrand]

plop

je sais être à la ramasse en génome, mais pourquoi, quand on souhaite insérer un gène dans un plasmide, on fait d'abord usage d'une phosphatase alcaline sur les extrémités du plasmide digéré ? car j'ai cru comprendre qu'il fallait justement utiliser la phosphatase alcaline pour éviter que ne se referme sur lui-même le plasmide, chose qui se ferait sans l'action d'une quelconque ligase.

[Clemsoin]

plop

je sais être à la ramasse en génome, mais pourquoi, quand on souhaite insérer un gène dans un plasmide, on fait d'abord usage d'une phosphatase alcaline sur les extrémités du plasmide digéré ? car j'ai cru comprendre qu'il fallait justement utiliser la phosphatase alcaline pour éviter que ne se referme sur lui-même le plasmide, chose qui se ferait sans l'action d'une quelconque ligase.

Si le plasmide se referme tout seul ça va être dur d'ajouter un gène d’intérêt ^^'

[Felgrand]

le fond de la question est que si le plasmide se renferme tout seul, il n'a pas besoin de ligase

or victorw dit que la ligase est absolument nécessaire

donc est-ce qu'il faut vraiment toujours une ligase ? si non, pourquoi faire usage d'une phosphatase alcaline ?

[Clemsoin]

Non la bactérie sait refermer toute seul 2 extrémités 5'P. Mais nous on ne veut pas que la bactérie se referme tout de suite après avoir coupé avec une endonucléases (à extrémités compatibles). On veut d'abord essayer d'insérer le gène d’intérêt. Du coup on met le phosphatase alcaline qui va coupé les 5'P. La bactérie ne sait alors pas se refermer toute seul. On ajoute notre fragment d'ADN avec des extrémités 5'Phosphate, de la ligase et de l'ATP pour reformer les liaisons phosphodiester.

Là si tu es attentif tu remarqueras qu'un des deux brins est 3'OH et que le plasmide est 5'OH. Mais ça pose pas de problème car la bactérie va savoir réparer tout seul en recréant de nouvelles liaisons phosphodiester.

 

(Si les enzymes de restrictions utilisées ne sont pas compatibles on aura pas besoin de faire tout ça)

[Felgrand]

merci !

donc effectivement, une ligase n'est pas une nécessité absolue

[Gwendoline_sabat]

 LA LIGASE EST ABSOLUMENT NECESSAIRE !

 

On veut donc insérer un fragment d'intérêt à l'intérieur du plasmide. Pour cela, on coupe le plasmide dans son MCS par une enzyme de restriction, par exemple EcoRI. Les extrémités produites sont donc compatibles. Si on ajoute notre fragment + de la ligase et de l'ATP à cet instant, le plasmide se refermera sur lui-même sans intégrer le fragment. Par conséquent, pour éviter ça, on utilise au préalable la phosphatase alcaline qui permet de déphosphoryler les extrémités 5'P afin que le plasmide ne soit plus en mesure de se refermer sur lui-même. Il sera alors "obligé" d'intégrer le fragment possédant des extrémités 5' P lorsqu'on l'ajoutera avec la ligase et l'ATP.
Certes, on ne crée que 2 liaisons phosphodiester donc il en manque 2 autres qui seront recréées dans la bactérie si le plasmide arrive à entrer dans la bactérie.

 

J'espère que c'est plus clair maintenant

[Felgrand]

ah merci

l'explication est très claire maintenant !

[Gwendoline_sabat]

Avec plaisir