Biologie moléculaire

[charlotte.p]

Bonjour, je ne comprends pas comment réaliser les schémas explicatif de la digestion enzymatique dans un clonage non orienté ? 

https://www.pdffiller.com/jsfiller-desk10/?requestHash=6286e108f926f24366baaa16c49c7f7ceaa782ac27301663c1729df9c1ac87cb&lang=fr&projectId=1637051910&PAGE_REARRANGE_V2_MVP=true&richTextFormatting=true&isPageRearrangeV2MVP=true&jsf-page-rearrange-v2=true&jsf-redesign-full=true&act-notary-pro-integration=true&jsf-fake-edit-embedded=true&isSkipEditorLoadFrequency=true&jsf-desktop-ux-for-tablets=false&jsf-probability-70=true&jsf-socket-io=false&routeId=c8888aad3d157ff7f7cb12cef514d609#00545141e3524b3aa7840c00b6f04948

 

C'est sur le td1 les questions 6 et 7 on nous a dit qu'il fallait dessiner le plasmide et les 2 clones que l'on obtient mais même avec la correction je ne comprends pas comment est faite la réunion des fragments

[Lali]

Hey, je crois qu'on peut pas voir ce que tu veux nous montrer avec le lien, sans se connecter sur le site

[charlotte.p]

https://drive.google.com/file/d/1St9qQB7AQ3NdeIM06YWy6afi5PfouIxF/view?usp=sharing

Avec ce lien ce sera mieux peut-être 

Mon problèmes de compréhension est à la question 6 du TD1. On nous a demandé de faire un schéma du plasmide et des 2 clones que l'on obtient avec les séquences de nucléotides mais je n'arrive pas à comprendre comment procéder

[Lali]

Okay, du coup dans les types d'excercices de ce genre, il faut que tu regarde la taille de nucléotides après digestion qui diffère pour faire ton schéma et de savoir de quel clone on parle. Dans la digestion avec BamHI et KpnI, on remarque que dans les deux clones on obtient la même taille de nucléotide ( environ 0,35 kb et 3 kb), celui-ci nous apporte pas beaucoup d'informations sur le type de clonage  mise à part que l'insert a bien été intégré dans le plasmide. Dans la digestion avec BamHi et EcoRI, on remarque que les tailles des fragments sont différents chez les deux clones, chez le clone 1 on a un fragment de 0,1 kb et environ 3,2 kb) tandis que chez le clone 2 on a un fragment de 0,2 kb et un autre d'environ 3,1 kb).

 

On sait que dans la séquence ADNc on a un site de restriction EcoRI. Disant que le site EcoRI se situe a 200pb en partant de l'ATG et que l'insert fait 500 pb. Selon que l'ATG de l'insert soit dirigé vers le promoteur ou non, la taille des fragments après digestion va différer car l'emplacement du site EcoRI va changer. C'est ce changement d'emplacement qui va alors te permettre de savoir quel clone a l'insert dans le bon sens. Du coup si par exemple, on fait une digestion et qu'on obtient un fragment de 300 pb et 3,2 kpb. On sait que notre insert est dans le bon sens car on sait que BamHI est situé à la fin de l'insert, du coté du codon stop. la distance du site EcoRI et le codon stop est de 300 pb. Par contre si lors de la digestion on obtient des fragments de 200 pb et 3,3 kpb, ça veut dire que le codon stop n'est plus du côté du BamHI car sinon on aurait obtenu un fragment de 300 pb donc ça veut dire que l'ATG est du côté de BamHi et on sait que la distance entre ATG et le site EcoRI est de 200 pb.

 

Bon j'espère t'avoir éclairé un peu plus, n'hésite pas si y'a des choses que t'as pas compris

 

Voici un petit schéma pour être un plus clair : https://zupimages.net/viewer.php?id=24/38/9s9j.jpg

[charlotte.p]

Merci pour explication je comprends mieux comment faire mais alors ce que je ne comprends pas c'est le schéma suivant : https://ibb.co/stCTnYP

La prof nous l'a fait au tableau en TD et je comprends pas comment avec les flèches vertes et noires on peut retrouver la séquence des clones 1 et 2 ? Le fluo ne veut rien dire c'est moi qui l'est rajouter en pensant avoir compris mais en faite pas du tout. J'ai l'impression qu'il y a des erreurs dans l'écriture des clones.

https://ibb.co/F841Drd et ça c'est une version plus propre des plasmides et clones.

Donc ma question c'est comment on trouve les sites de liaisons à partir de ces plasmides ? J'ai beau suivre les flèches je n'y arrive pas

 

[Lali]

Je t'avoue que j'ai du mal à comprendre ce schéma,  mais pour le site de liaison, ça résulte de la combinatoire entre le site de restriction coupé en 2 et les trois premiers/derniers  nucléotide de l'insert. C'est le site de restriction de EcoRV qui est coupé en deux. Du coup on a 5' GATATC'3. Lors de la digestion, on va avoir une coupure franc et obtenir  5'GAT'3 et 5'ATC'3. On va à présent avoir l'insertion de l'ADNc. Dans le cas d'une insertion dans le bon sens on va avoir 5' GAT ATG'3 et 5' TAG ATC 3' (sur la ligne la plus extérieure du plasmide) puis dans le cas de mauvais sens ça va être peu plus compliqué parce que je ne comprend pas pour la correction du TD .

 

Dans le cas du mauvais sens j'aurai pensé à 5'GAT GAT'3 mais il semblerait que l'insert est retourné.  Donc la coupure du côté vers BamHI, on a 5'GAT CTA'3 et on devrait avoir 5' CAT ATC 3' ( ligne la plus extérieure) mais sauf qu'on ne voit pas la deuxième partie avec 5'CAT3' apparaître dans la correction donc il y a un problème, de plus la façon dont sont écris les sites de liaisons selon les deux clones ne sont pas les même donc ça porte confusion

 

Les flèches indiquaient juste l'endroit où se plaçaient les extrémités de l'insert. Dans le schéma du clone 1, la flèche partant de l'ATG montre que le brin sens va s'insérer au niveau du 5'GAT3' de le brin externe du plasmise et la flèche partant du brin complémentaire se positionne au niveau du 5'GAT'3 du brin interne du plasmide. Et on voit que dans le schéma du clone 2 c'est l'inverse. Je ne sais pas quel promoteur est utilisé dans le protocole mais dans mes explications j'ai considéré le pAmp comme promoteur, je me suis rendue compte un peu tard que c'est sans doute pour un antibio (donc mon mauvais sens (clone 2) et mon bon sens (clone 1) sont inversés, mais le principal c'est que tu comprenne le principe.

[charlotte.p]

Merci pour ton explication. Mais du coup je ne comprends toujours pas pourquoi GAT est en 5' et CTA en 3' car sur le schéma c'est l'inverse ? C'est le schéma qui est faux ? ( ça ne serait pas étonnant car la prof n'a fait que se tromper. Et on a coupé avec BamHI / KnpI et BamHI / EcorI. 

Désolé mais je suis vraiment perdu

Et pareil je ne comprends pas non plus pour TAG et ATC 

[charlotte.p]

C'est bon merci j'ai compris je ne regardais pas au bon endroit