a l'aide +++ lecture de plasmide

[ellaratersapass]

salut 

malgré mes efforts je ne comprend toujours pas comme on lie un plasmide je comprend rien si quelqun peu m'aider ?

[Vector]

Heey @ella.lbt ! 

 

Est ce que tu peux me préciser la nature de ton problème pour pouvoir y répondre au mieux ? 

 

Est ce un problème avec les éléments présents dans un plasmide ?

Est ce un problème concernant l'utilisation des promoteurs ?

Est ce un problème concernant les sites et les enzymes de restriction ?

Est ce un problème sur l'utilisation d'un plasmide ?

Ou encore un problème sur une résolution d'exercice ? 

Ou quelque chose d'autre ? 

 

Sinon ne t'en fais pas on peut tout reprendre !

Merci

 

Edited March 20, 2024 by Vector

[ellaratersapass]

c'est tout ça par ce que je comprend pas ce qui faux chercher sur le plasmide 

[ellaratersapass]

ducoup?

 

[Vector]

2 secondes, je suis en train de te faire une réponse un peu longue . 

 

 

[ellaratersapass]

  On 3/21/2024 at 12:37 PM, Vector said:

2 secondes, je suis en train de te faire une réponse un peu longue . 

 

 

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Pardon juste vue que tavais liker je me suis dis peut etre tallais pas repondre 

[Vector]

Alors je vais essayer de tout reprendre, n'hésite pas si quelque chose n'est pas clair !

 

Structure : 

 

Un plasmide est formé d'ADN bicaténaire (double brin) circulaire d'origine bactérienne. Cet ADN est indépendant des chromosomes ce qui fait qu'on peut le transférer d'une cellule à une autre très facilement. 

Sur ces plasmides on trouve plusieurs éléments : 

- une origine de réplication notée ORI. Cette origine correspond à la position 0 (on va donc compter les distances en paires de base à partir de l'origine).

- des promoteurs (associés au non à des gênes) et des terminateurs qui vont servir de lieu de fixation pour les enzymes de transcription. Tout ce qui se situe après un promoteur  et avant un terminateur sera transcrit. 

- Des gènes de résistances permettant de sélectionner les clones bactériens en fonction de certains antibiotiques.

- Des sites de restrictions. Les sites de restrictions correspondent à des séquences particulières d'ADN, dites semi-palindromiques. Ces séquences seront reconnus par des enzymes particulières : les enzymes de restriction, qui clivent (coupent) les deux brins d'ADN au niveau du site de restriction. La position du site de restriction est déterminée en fonction de sa distance en paire de base avec l'origine. 

 

Zoom sur les promoteurs : 

Il existe plusieurs types de promoteur. Le type de promoteur va déterminer les conditions d'expression de la séquence qui suit le promoteur (il est donc primordial de le choisir correctement. 

- promoteur eucaryote : transcription uniquement chez les organismes eucaryotes.

- promoteur procaryote : transcription uniquement chez les organismes procaryotes.

- promoteur constitutif eucaryote ou procaryote : permet la transcription dans n'importe quel type de cellule eucaryote ou procaryote.

- promoteur tissu spécifique eucaryote ou procaryote : permet la transcription dans un certain type de cellule eucaryote ou procaryote.

 

Zoom sur les enzymes de restriction : 

Il existe plusieurs types d'enzyme de restriction : HindIII, BamH1, EcoR1 ...

Quand l'ADN est coupé par une enzyme de restriction sur un site de restriction, la coupure a une forme particulière qui dépend de l'enzyme utilisée. Ca fait que un brin d'ADN coupé par une enzyme ne pourra se lier qu'avec un site coupé par la même enzyme (un site compatible). 

 

Le clonage est dit non-orienté si c'est la même enzyme qui coupe les deux extrémités et orienté si les deux extrémités sont coupées par des enzymes différentes (étant donné que les deux extrémités ne sont pas identiques, la séquence ne peut s'insérer que dans un sens = orienté). 

 

 

Réalisation d'un clonage : 

 

Donc imaginons que j'ai une séquence d'ADN et que je souhaite l'insérer dans un plasmide. 

 

1ère étape : je détermine le promoteur dont j'ai besoin et je le repère sur le plasmide. Je sais que ma séquence d'ADN devra faire suite à ce promoteur (après la flèche).

 

2eme étape : je coupe mon plasmide avec une ou plusieurs enzymes située.s après le promoteur. Je dois m'assurer que ces mêmes enzymes peuvent couper les deux extrémité de ma séquence sans l'altérer (je ne dois pas utiliser une enzyme qui coupe en plein milieu de ma séquence).

premier cas de figure : utilisation d'une seule enzyme

l'enzyme va couper le plasmide et va l'ouvrir (les deux extrémité ainsi créer sont donc identiques). Je pourrais donc insérer ma séquence dans n'importe quel sens (clonage non orienté).

deuxième cas de figure : utilisation de deux enzymes différentes 

Les enzymes vont couper à 2 endroits différents, on aura donc au minimum 2 fragments. Le fragment le plus petit compris entre les deux sites de restriction sera éliminé et remplacé par ma séquence. La séquence ne pourra s'insérer que dans un sens étant donné que les deux sites sont différents (clonage orienté).

 

Il faut ensuite faire attention au nombre de site de restriction. Si je décide d'utiliser une enzyme de restriction particulière, celle ci va couper tout les sites de restriction correspondant sur le plasmide. Le nombre de site de restriction détermine le nombre de fragment que tu obtiens. Ca peut être la source de piège car certains sites coupent en plein milieu des promoteurs ou des séquences. 

 

L'insertion de la séquence modifie la taille du plasmide ainsi que la position de tous les éléments en aval (il faut donc les recalculer en prenant compte du nombre de bases éliminées et ajoutées). 

 

 

 

A ce stade si j'ai bien réaliser mon clonage j'obtiens  un transgène composé de 3 éléments à la suite (tu les auras toujours toujours toujours) :

1 promoteur + ma séquence + 1 terminateur (+ éventuellement une séquence de détection, par ex : 6His)

 

Je pourrais donc ensuite utiliser d'autres sites de restriction pour couper de part et d'autre de mon transgène pour le récupérer et enlever tout les éléments du plasmide qui ne m'intéressent pas. 

 

Le plasmide sert juste à positionner les différents éléments pour récupérer ensuite un transgène fonctionnel : choix du promoteur, insertion de la séquence, type de clonage ...

 

Je sais pas si j'ai été clair et si j'ai répondu à ta question ?

Mais j'espère que c'est plus clair !

 

 

PS : si tu veux j'ai corrigé un exo de plasmide dans ce sujet :

 

 

 

Edited March 21, 2024 by Vector